Génie chimique,
Génie des procédés,
Option bio-procédés








Analyses microbiologiques






Objectif


On veut analyser la composition microbiologique de l'eau de l'Isle prélevée dans une bouteille stérile afin de déterminer son niveau de pollution.

On cherche à déceler la présence de micro-organismes tels qu'Escherichia coli, Entérocoques et Coliformes fécaux.





Protocole expérimental



Dans un premier temps, on effectue un état frais ainsi qu'une coloration de Gram pour déterminer les caractères morphologiques, l'arrangement et la mobilité des éventuels micro-organismes présents dans l'eau.




ETAT FRAIS


Mode opératoire :

On travaille en milieu stérile, soit dans un rayon de 15 cm autour de la flamme d'un bec bunsen.

Dans un premier temps, on stérilise l'anse de prélèvement au bec Bunsen. On prélève alors l'eau de rivière à analyser.

On dépose la goutte d'eau prélevée au centre d'une lame propre et on recouvre avec une lamelle en veillant à ce que le liquide ne déborde pas.



On procède ensuite au lutage : on scelle la lamelle à la lame en réalisant un cadre de paraffine. Cela permet de réduire les risques de contamination et les courants liquidiens qui perturbent la lecture.

Etant donné que l'oxygène ne peut pas traverser la paraffine cela provoque la mort rapide des bactéries aérobies strictes qui sont alors forcément immobiles ; il faut donc rapidement faire l'observation au microscope.

L'observation au microscope se fait avec le condenseur abaissé, le diaphragme ouvert et l'objectif en position *40.



On effectue la mise au point et la lecture.


Observations :




On observe de nombreuses coques immobiles, en chaînettes ou en amas mais également isolées (3, 6, 7). On note aussi la présence d'êtres pluricellulaires (1, 2), de fibres (5) et de bacilles immobiles en bâtonnets groupés par deux (7).


1
2
3
4



5
6
7


Tous ces micro-organismes sont très éparpillés.





COLORATION DE GRAM :

Découverte en 1883 par Mr Gram tout à fait par hasard, la coloration de Gram a été utilisée par la suite par le Dr Roux qui était en collaboration avec Mr Pasteur pour identifier les bactéries.


Principe :

Les bactéries sont soumises à l'action du violet de gentiane en présence d'iode comme mordant, puis traitées à l'alcool. Elles se différencient alors en deux groupes :


Mode opératoire :

On travaille en milieu stérile.

On commence par réaliser un frottis : on prélève stérilement une goutte d'eau à la anse et on l'étale en ronds concentriques sur la lame. Le frottis doit faire environ un centimètre de diamètre.

On laisse sécher sur la veilleuse du bec Bunsen puis on fixe les bactéries en recouvrant le frottis d'alcool pendant environ 5 secondes.

On jette l'alcool à l'évier et on flambe la lame que l'on laisse refroidir à température ambiante.

Une fois que le frottis est prêt, on le recouvre de violet de gentiane et on laisse agir 30 secondes minimum. Puis on recouvre le frottis de lugol que l'on laisse également agir pendant 30 secondes.

Note : le lugol est un mordant qui favorise la fixation du violet dans le corps bactérien.

A l'issue de ce temps, on rince à l'eau distillée et on décolore à l'alcool pendant 2 à 3 secondes maximum. Dès que ce qui s'écoule n'est plus violet, on arrête la décoloration par un jet de pissette d'eau distillée.

On recouvre le frottis de fuchsine de Zhiel et on laisse agir une minute.

On lave à l'eau distillée et on sèche la lame entre deux feuilles de papier filtre.

On procède alors à l'observation microscopique.

Elle se fait avec le condenseur relevé au 3/4. La mise au point se fait avec l'objectif *40 puis, après dépôt d'une goutte d'huile de paraffine (huile à immersion) sur la préparation et sans modifier le réglage, on met en position l'objectif *100.

On effectue la lecture.


Observations :

Après plusieurs colorations de Gram, nous n'avons rien observé au microscope. Cela doit être lié au fait que les microorganismes étaient très éparpillés.





DENOMBREMENT DES MICRORGANISMES ET CONCLUSIONS :

On effectue la numération sur les milieux sélectifs suivants :

Afin de pouvoir effectuer la numération, on décide de faire des dilutions de l'eau de l'Isle jusqu'au millième.

Dilution Volume d'eau de l'Isle
(en mL)		 Volume d'eau distillée
(en mL)		 Volume final
(en mL)
1 20 0 20
1/10 10 90 100
1/100 1 99 100
1/1000 1 de la dilution 1/10 99 100



Mode opératoire :

On travaille en milieu stérile.

Pour préparer les dilutions, chaque volume d'eau de rivière est prélevé avec une pipette jaugée de volume adapté.

Pour les dilutions de 1/10 à 1/1000, on introduit le volume d'eau à analyser dans une fiole jaugée de 100 mL et on complète à l'eau distillée jusqu'au trait de jauge. Puis on homogénéise la solution.

Ensuite, on procède à la filtration sous vide de 20 mL d'une dilution sur un filtre spécial. Le vide est fait grâce à une trompe à eau.

Note : Avant chaque prélèvement, on veille à homogénéiser la solution d'eau à analyser.



Le filtre est alors récupéré et déposé sur un milieu sélectif.

On répète cette manipulation jusqu'à ce que chacune des dilutions soit filtrée et déposée sur chacun des milieux sélectifs cités plus haut.



Les milieux sélectifs sont alors mis à l'étuve dans les conditions suivantes :



Résultats :

Les résultats du dénombrement de chaque milieu après culture sont regroupés dans le tableau ci-dessous :

Milieu EMB
Milieu de Slanetz
Milieu
Désoxy-Cholate-Lactose
Dilution 1
Environ 300
170
13
Dilution 1/10
52
2
1
Dilution 1/100
8
31
0
Dilution 1/1000
0
0
0



Observations après culture :




Milieu EMB : on observe des colonies de couleurs rosées. Ce sont des colonies de petites tailles (diamètres inférieurs à 1mm), bombées, brillantes, à bords réguliers et filantes. On en déduit que ce sont des colonies de type M.

On note aussi la présence d'une dizaine de colonies roses de grandes tailles (diamètres supérieurs à 3 mm), à bords irréguliers avec une tendance à l'étalement mais lisses.

Les colonies n'étant pas de couleur verte grisâtre, on en déduit qu'il y a absence d'Escherichia coli dans l'échantillon prélevé.




Milieu de Slanetz : on observe la présence de colonies roses de petites tailles (diamètres inférieurs à 1 mm). Elles sont semi-bombées, à bords réguliers et brillantes. Certaines sont de tailles moyennes (2 à 3 mm de diamètre). Il s'agit donc de colonies de type S.

La présence de ces colonies roses de tailles moyennes met en évidence la présence d'entérocoques fécaux. On peut donc conclure que l'eau de l'Isle contient des entérocoques fécaux dont l'origine peut être expliquée par des rejets directs des habitations qui ne sont pas reliées aux réseaux d'eaux usées.




Milieu Désoxy-Cholate-Lactose : on observe des colonies blanches de très petites tailles (diamètres inférieurs à 1 mm), bombées, brillantes et bords réguliers. Il s'agit de colonies de type S. Ces colonies n'étant pas de couleur rouge, on peut dire que cet échantillon d'eau ne contenait pas de coliformes fécaux.





Les descriptions des milieux (compositions, caractéristiques...) sont disponibles à l'adresse suivante :
http://www2.ac-lyon.fr/enseigne/biotech/microbio/milieux.html



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